生体分子の研究法

^生物学の研究技術^

生体分子の研究法: 生物学ではあらゆる生体物質がその研究対象となりうる。主立ったものとしては DNA、RNA、タンパク質、脂質、糖質があげられる。ここではそれらの扱い方について述べる。これらを扱う分野は、生化学、分子生物学、生物物理学、生理学などである。

DNA

概論

DNA は RNA ウイルスを除き、全ての生物で遺伝情報をコードしている。このため遺伝情報を調べるためには DNA を扱う必要がある。まず常法では DNA の単離から始めるが、扱う対象がゲノム DNA であるかプラスミドであるかによって操作が多少異なる。長い DNA 断片は物理的に切れやすいため、短い環状のプラスミドよりも操作に注意する必要がある。

DNA の抽出はタンパク質を分解、変性させて遠心により分離し、RNA を リボヌクレアーゼ( ribonuclease, RNase )によって分解することで行う。大腸菌からのプラスミド抽出は、分子生物学では特に頻繁に行われるため、様々な市販のキットや、操作を自動化するロボットも販売されている。収量や精度に応じて様々な手法がある。

配列特異性をもって DNA を切断する制限酵素はもっとも重要なツールの一つである。様々な制限酵素が単離され、市販されており、通常はこれらを購入して用いる。制限酵素は、適切な条件下では、特異的な回文配列を認識して切断する。DNA リガーゼ( DNA ligase )は逆に DNA 断片を結合させる酵素であり、この二種類の酵素によって DNA の切り貼りが可能となる。これらの操作で任意の DNA 断片を調製し、プラスミドに組み込ませ、それを大腸菌に取り込ませ培養することで増幅させるのが、遺伝子クローニングの基本である。

また任意の塩基配列をもつ DNA 断片を調べる方法としてサザン解析が開発されている。サザン解析は DNA を制限酵素で処理した後、電気泳動で長さごとに展開し、メンブレンに写し取る。メンブレンに対し、放射性同位体やディゴキシジェニン (DIG) などでラベルした相補鎖をハイブリダイズさせることで、任意の断片を検出する。

塩基配列を解析する場合は、シーケンシング( Sequencing )が行われる。

各論

• 抽出
  • プラスミドのミニプレップ
  • 細胞からのゲノム抽出
  • 組織からのゲノム抽出
  • フェノールクロロホルム法
  • キットの利用
  • 超遠心法
• 制限処理
  • 制限酵素
• アガロースゲル電気泳動
• サザンブロッティング
  • ブロッティング
  • バイブリダイゼーション
• PCR
• クローニング
  • プラスミド
  • ライゲーション
  • 形質転換
  • 培養
  • コンピテントセル
• シーケンシング
• フットプリンティング
• ゲノムライブラリー
• 基本試薬

RNA

概論

RNA は遺伝子の転写産物であり、発現している遺伝子の情報を得る手がかりとなる。RNA を分解する RNase は、組織や細胞内の他、汗や唾液などいたるところに存在しており、実験操作中に混入しやすく、しかも失活しづらいことから DNA を扱うよりも注意が必要である。

各論

• 抽出
• ノザンブロッティング
• RT-PCR
• cDNA ライブラリーの作成
• ディファレンシャルディスプレイ

タンパク質

• 概論
• 抽出
• プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤
• ウェスタンブロッティング
• 免疫沈降法
• 酵母ツーハイブリッド法
• ELIZA
• 二次元電気泳動
• アミノ酸配列の決定